【科技前沿·观察】开启成熟（Turn-on Maturation）的新型荧光生物传感器设计平台

　　■北京大学跨学部生物医学工程系PI，研究员，“国家优秀青年基金”、中科协“青年人才托举工程”、中科院“青年创新促进会优秀会员”和“卢嘉锡青年人才奖”获得者。

　　■北京大学跨学部生物医学工程系博士生，曾获国家奖学金、国家励志奖学金，第七届中国国际“互联网+”大学生创新创业大赛全国银奖。已发表SCI论文3篇，获得国家发明专利2项。

　　基于单个荧光蛋白的生物传感器（FPBs, fluorescent protein-based biosensors）使我们大家可以对细胞和生物体内的生化过程进行高灵敏、定量的可视化研究，革新了我们认识和理解生命活动的方式。从工作原理上来讲，FPBs大致上可以分为两类。其一为持续发光的周转型（Turnover-based）传感器，此类传感器的“关”状态是由于它们在合成后不断被细胞内的泛素-蛋白酶体识别和降解，但与配体结合后，传感器的稳定性提高，降解被抑制，荧光信号便可在细胞内累积；另一类为开启型（Turn-on-based）传感器，即无配体存在时，传感器由于设计引入的结构缺陷无法发光，配体结合后传感器构象发生转变，形成有利于发色团发光的环境，荧光信号增强。开启型荧光传感器中最有一定的影响力的例子之一是基因编码的钙指示剂（GECI，genetically encoded calcium indicator），如GCaMPs家族，由于其强大而可逆的荧光开启和快速的动力学特性，慢慢的变成了神经和细胞生物学中很重要的研究工具。GECI通常由循环排列的荧光蛋白（cpFP, circularly permuted fluorescent protein）和受体序列融合而成。cpFP的发色团虽然能够成熟，但处于质子化状态，因此无法发射荧光或荧光寿命降低。钙离子的结合首先引起GECI中受体的构象变化，该变化进一步传导至cpFP，使得其中的发色团去质子化，因此导致荧光强度的变化。然而，GECI的传感机制并不适用于靶向其他配体的Turn-on型荧光传感器设计。例如，将GECI的识别结构域替换为靶向其他配体的抗体类似物（monobodies、nanobodies、DARPins、affibodies等）后，配体的结合并没有引起抗体类似物的明显构象变化，从而也无法转化为“报告结构域的荧光开启”。因此，FPBs的发明者面临的一个主要挑战是如何基于单个荧光蛋白构建一个高适应性的传感器开发平台，使得在新的研究需求或目标出现时，能够迅速进行定制和调整，而不需要重新设计整个传感器。

　　近期，美国纽约州立大学上州医科大学Stewart N. Loh团队在Nature Methods在线发表题为Adaptable, turn-on maturation (ATOM) fluorescent biosensors for multiplexed detection in cells的研究论文。在该研究中，他们首次提出了一种开启型FPBs的普适性设计策略，并开发了ATOM（adaptable，turn-on maturation）传感器。这些传感器可以通过引入不同的受体和荧光蛋白（FP），迅速适应并识别多种目标，在细胞中实现多重检测。ATOM传感器的工作机制包括与配体结合时诱导发色团环化和成熟，这与传统的GECI（基因编码的钙指示剂）和周转型传感器有所不同。

　　Stewart N. Loh团队在前期工作中发现，将循环重排的FK506结合蛋白（FKBP）插入到循环重排的黄色荧光蛋白（cpYFP）的β10与β11链之间的环状区域（loop），所构建的融合蛋白在结合FK506时表现出高达35倍的黄色荧光增强（John, A. M. et al., ACS Sens., 2022）。基于相似策略，在本研究中，研究人员将特异性识别配体的monobodies（MBs）或nanobodies（NB）作为ATOM传感器的受体，分别选取了MB的两个loop区（MB1和MB2）以及NB的四个loop区（NB1 – NB4），进行循环重排，形成cpMBs或cpNBs（图2a）；接着将Clover FP的黄色突变体在β9与β10链之间进行循环重排，形成cpYFP；最后将cpMB或cpNB分别插入cpYFP的三个表面loop区：β7–β8（FP1）、β8–β9（FP2）、β10–β11(FP3）（图2b），构成一个小型的ATOM传感器库。当cpMBs或cpNBs未结合配体时，呈部分折叠状态，破坏cpFP的天然构象，使cpFP发色团处于未成熟状态；当配体与cpMBs或cpNBs结合时，将诱导其折叠，恢复cpFP的天然构象，允许其发色团成熟，由此产生特异性配体依赖的荧光开启效应（图2c）。在人源细胞中对基于MB的 y-ATOM传感器库进行筛选，以确定哪个MB循环重排位点与cpYFP插入位点的组合显示出最大的荧光增强。对每个配体，有六种可能的y-ATOM生物传感器。通过测试所有三种配体的18种可能组合中的15种组合，最终找到了最佳性能的传感器（图2d）。采用相同的设计方法，研究者也在人源细胞中成功筛选出基于NB的y-ATOM传感器（图2e）。有必要注意一下的是，虽然大多数MB/NB-FP组合都显示出显著的荧光增强，但没有哪个单一的YFP插入位点和MB循环重排位点的组合被证明是最成功的，不同组合在不同传感器中表现最佳。

　　在前文基础上，研究者通过将靶向不同配体蛋白（WDR5、hRAS、SH2）的MB或NB插入到不同FP（mTagRFP、mTurquoise、YFP）的β链之间的loop区，设计了三个ATOM荧光生物传感器，即r-ATOMWDR5、c-ATOMRAS、y-ATOMSH2。这些传感器不但可以在单一细胞中对单一目标进行高效检测，还能够最终靠多路复用成像（multiplexed imaging），对定位在三种亚细胞器（质膜/ 细胞质/ 细胞核）的三个靶标（hRAS/ SH2/ WDR5蛋白）进行同步检测（图3）。

　　与周转型传感器相比，ATOM传感器在不同的亚细胞结构中的操作不受到蛋白质合成或降解机制的限制，只有和目标定位在相同细胞器时才被开启，并且在内质网、细胞质和线粒体中均表现出相同的良好功能。另外，研究者在两种细胞系验证了ATOM传感器检验测试内源性蛋白并确定其定位的能力。

　　总之，本文提出了一种新的开启型FPBs开发平台，即通过少量模块化选择、组合和筛选，在不同结合特异性和颜色的情况下快速生成功能ATOM传感器，与此前开发的许多基于单个荧光蛋白的生物传感器所需的大量库和多次迭代形成鲜明对比。ATOM传感器的设计具有高度的可定制性，使其可以迅速适应不一样的目标，为细胞内多重检测提供了一种灵活且高效的解决方案。

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